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NobleRyder 一步克隆試劑盒

  • 型   號(hào):CLO01-20
  • 價(jià)   格:
  • 更新時(shí)間:2024-11-21
  • 廠家性質(zhì):經(jīng)銷商

NobleRyder CLO01-20 一步克隆試劑盒 NobleRyder® One Step Cloning Kit 20T
NobleRyder CLO01-50 一步克隆試劑盒 NobleRyder® One Step Cloning Kit 50T
NobleRyder 一步克隆試劑盒

NobleRyder  CLO01-20  一步克隆試劑盒  NobleRyder® One Step Cloning Kit  20T

 

產(chǎn)品品牌:NobleRyder

產(chǎn)品貨號(hào):CLO01-20

產(chǎn)品名稱:一步克隆試劑盒

英文名稱:NobleRyder® One Step Cloning Kit

產(chǎn)品規(guī)格:20T

 NobleRyder 一步克隆試劑盒

產(chǎn)品簡(jiǎn)介:

NobleRyder® One Step Cloning Kit是一款簡(jiǎn)單、快速、高效的DNA定向克隆技術(shù),可以將插入片段定向克隆至任意載體的任意位點(diǎn)??梢愿咝Ъ嫒?span>1-5個(gè)片段同源重組,50℃反應(yīng)10 - 30 min即可進(jìn)行連接,適用于快速克隆,DNA定點(diǎn)突變等。

組分

CLO01-20

CLO01-50

2×NobleRyder® One   Step Cloning Mix

100 μL

250 μL

700bp Control Insert   (10ng/μL)

pCold Control   Vector,linearized(20ng/μL)

5 μL

10 μL

5 μL

10 μL

 

實(shí)驗(yàn)流程

1.制備線性化載體

  選擇合適的克隆位點(diǎn),并對(duì)載體進(jìn)行線性化。盡量選擇無(wú)重復(fù)序列且載體克隆位點(diǎn)上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點(diǎn)進(jìn)行克隆。載體線性化方式有限制性內(nèi)切酶酶切消化和反向PCR擴(kuò)增。1)酶切制備線性化載體時(shí),推薦使用雙酶切線性化,線性化wan全5.1 制備線性化載體

  選擇合適的克隆位點(diǎn),對(duì)載體進(jìn)行線性化。選擇載體克隆位點(diǎn)附近無(wú)重復(fù)序列且上下游20bp區(qū)域內(nèi)GC含量在40%-60%之間的位點(diǎn)進(jìn)行克隆。

1)酶切制備線性化載體,推薦使用雙酶切方案;單酶切線性化并不影響無(wú)縫鏈接,但可能會(huì)有更多的環(huán)狀質(zhì)粒殘留,增加后期克隆的篩選難度。

2)反向PCR擴(kuò)增制備線性化載體,必須使用高保真DNA聚合酶進(jìn)行載體擴(kuò)增,以減少擴(kuò)增突變的引入。PCR產(chǎn)物需要進(jìn)行膠回收,減少環(huán)狀質(zhì)粒環(huán)狀DNA模板的殘留。

2.制備插入片段

  通過(guò)在插入片段正、反向引物5,端引入15-25bp線性化載體末端同源序列,使得插入片段PCR產(chǎn)物5,端和3,端的末端分別帶有與線性化載體的兩個(gè)末端對(duì)應(yīng)的wan全一致的序列。使用高保真PCR Mix完成擴(kuò)增,獲得PCR產(chǎn)物后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳分析,并回收正確的產(chǎn)物片段。

  插入片段正向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式:

  5-上游載體末端同源序列+酶切位點(diǎn)(保留或刪除)+基因特異性正向擴(kuò)增引物序列-3

  插入片段反向擴(kuò)增引物設(shè)計(jì)方式:

  3-基因特異性反向擴(kuò)增引物序列+酶切位點(diǎn)(保留或刪除)+下游載體末端同源序列-5

 


3.線性化載體與插入片段濃度測(cè)定

  使用NanoDropQubit檢測(cè)線性化載體和插入片段的濃度。

4.重組反應(yīng)體系的配制

1)線性化載體和插入片段使用量計(jì)算

載體與插入片段摩爾比為1:2 ~ 1:3;當(dāng)插入片段長(zhǎng)度大于克隆載體時(shí),將插入片段當(dāng)作克隆載體,克隆載體當(dāng)作插入片段計(jì)算。

2)在冰上配制反應(yīng)體系:

組分

實(shí)驗(yàn)組

陰性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照

線性化載體

X

X

pCold Control   Vector,linearized  1 μL

插入片段

Y

0

700bp Control Insert

1 μL

2×NobleRyder® One   Step Cloning Mix

5

0

5 μL

DNase-Free Water

to 10μL

to 10μL

to 10μL

3) 使用移液器輕輕吸打混勻并瞬時(shí)離心。

4 50℃反應(yīng)20min, 4℃維持或取出后置于冰上冷卻。

5) 重組反應(yīng)轉(zhuǎn)化、涂板,具體方法參照感受態(tài)細(xì)胞的說(shuō)明書。

 

產(chǎn)品訂購(gòu)信息:

NobleRyder  CLO01-20  一步克隆試劑盒  NobleRyder® One Step Cloning Kit  20T

NobleRyder  CLO01-50  一步克隆試劑盒  NobleRyder® One Step Cloning Kit  50T

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