零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
零背景平末端快速連接試劑盒是一種優(yōu)良的zi殺基因陽性選擇克隆系統(tǒng),可以高效克隆平末端 PCR 產物和任何具有平末端的DNA 片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效。零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
ZERO-Blunt零背景平末端快速克隆試劑盒
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理
目錄號:42018
試劑盒組成、儲存、穩(wěn)定性:
試劑盒組成 | 20次(42018-20) | 40次(42018-40) |
pZERO-Blunt Vector(40ng/ml) | 20 ml | 40 ml |
1K bp Control(40ng/ml) | 5 ml | 5 ml |
2 ′ Quick Ligation Buffer | 100 ml | 200 ml |
T4 DNA ligase, 5U/ml | 20 ml | 40 ml |
pZERO-Blunt Forward Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
pZERO-Blunt Reverse Sequencing Primer (10µM) | 100 ml | 200 ml |
-20℃儲存,6個月內不影響使用效果。
v 產品介紹:
零背景平末端快速連接試劑盒是一種優(yōu)良的zi殺基因陽性選擇克隆系統(tǒng),可以高效克隆平末端 PCR 產物和任何具有平末端的DNA 片段。該試劑盒對磷酸化或非磷酸化的 DNA 片段都有效。 陽性選擇載體和插入片段連接僅需 5 分鐘即可獲得超過 95%的陽性重組克隆。由具有校正活性的聚合酶(如:Pfu polymerase)擴增的平末端 PCR 產物可直接連入克隆載體。連接產物可直接轉化常用的大腸桿菌菌株。
試劑盒提供一個新穎的zi殺基因陽性選擇克隆載體pZERO-Blunt。該載體含有致死的zi殺基因(內含多克隆位點),當載體與片段連接成功,zi殺基因無法正確表達,包含重組子的細胞可以正常生長;當載體與片段連接不成功,載體自連后zi殺基因正確表達,包含自連空載體的細胞無法存活,即“零ZERO"背景。這種陽性篩選策略無需藍白斑篩選,極大地加速了克隆篩選進程。
為方便酶切作圖和插入片段基因操作,pZERO-Blunt克隆載體的多克隆位點兩側各包含一個BglII識別序列。此外,該載體含有T7啟動子,可用于體內或體外轉錄、插入片段測序等研究。
操作步驟:
1. 連接反應的準備:
平末端PCR產物或者酶切后平末端片段可以通過瓊脂糖凝膠電泳分離回收(使用長波紫外光下切膠或者可見光透射切膠避免DNA損傷造成連接失?。Ec載體的摩爾比是 3:1。本公司生產的DNA產物快速純化回收試劑盒對70bp以上的DNA片段能很好地進行回收。
2. 快速連接反應:
1) 在一個標準的10 ml連接反應體系中,加入1 ml 40ng pZERO-Blunt 載體、X ml PCR產物(在通常狀況下,沒有必要對PCR產物進行精確定量,一般PCR產物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1就可以得到良好結果,推薦3:1,見附錄)、5ml 2 ′ Quick ligation Buffer和0.9ml 的T4 DNA Ligase,其余用滅菌水補足。
反應按以下體系進行:
5ml | 2 ′ Quick Ligation Buffer |
1ml | pZERO-Blunt 載體 |
Xml | 純化后的PCR產物/或者1ml 1000bp control |
Yml | 滅菌水 |
0.9ml (5 Weiss Units/ml) | T4 DNA Ligase |
Final Volume | 10ml |
一般最后加入T4 DNA Ligase。
2) 22℃連接5-10分鐘(一般可在PCR儀器完成)。
通常推薦22℃連接5-10分鐘 ,>3kb長片段連接可以延長至30分鐘。不推薦超過30分鐘,超過可能降低轉化子數(shù)量。
3) 冰上冷卻,然后轉化或貯存于-20℃。
3. 轉化:
1) 100ml感受態(tài)細胞,置于冰上,wan全解凍后輕撣幾次將細胞均勻懸浮。
2) 加入4-5ml連接液(最多可全部加入,只要連接液體積不超過感受態(tài)細胞體積的1/10),輕輕混勻。冰上放置30分鐘。
3) 42℃水浴熱激90秒。冰上放置2~3分鐘。
4) 加500ml LB或者SOC培養(yǎng)基(不含抗生素),37℃ 150 rpm振蕩培養(yǎng)60分鐘。
5) 將200ml細菌涂布在氨芐青霉su(100mg/ml)平板上。
涂布細菌的用量依連接的效率及感受態(tài)細胞的感受率而進行適當?shù)恼{整,如果 預計的克隆較少,可通過離心(4,000rpm,2 分鐘)后吸除部分培養(yǎng)液,留下適量的培養(yǎng)基懸浮菌體后取全部或者適量涂布于一個平板中(涂布剩余的菌液可以擱在4度保存,第2天如果轉化菌落數(shù)量少,可將剩余菌液全部涂一個新培養(yǎng)板)。
6) 平板在37℃下正向放置1小時以吸收過多的液體,然后倒置培養(yǎng)過夜。
5 篩選:
1). 常規(guī)檢測:將得到的菌落接種 1-5 ml LB(含有終濃度為 100mg /ml 的氨芐青霉su)培養(yǎng)基,37℃搖床振蕩培養(yǎng)過夜,保存菌種后提取質粒,應用 PCR 或酶切方法鑒定插入片段是否正確。
2). 快速檢測:挑取菌落直接進行PCR檢測(可參見分子克隆第3版本或者參考本公司CV05-通用T載體菌落PCR鑒定試劑盒說明書)。
3). 測序鑒定:使用試劑盒自帶引物或者T7啟動子引物測序確定是否含有目的克隆。
本試劑盒自帶測序引物(也用于菌落PCR鑒定引物):
Forward sequencing primer, 23-mer | 5’-CGACTCACTATAGGGAGAGCGGC-3’ |
Reverse sequencing primer, 24-mer | 5’-AAGAACATCGATTTTCCATGGCAG-3’ |
v 附錄:
e 如何計算連接反應中需要的PCR產物的量?
一般PCR產物與載體的摩爾比優(yōu)化至1:1~10:1(推薦3:1)就可以得到良好結果,可采用以下公式:
[加入載體的量(ng)×插入片段大?。╧b)÷載體大?。╧b)]×插入片段和載體的摩爾比=插入片段的量(ng) 例如:插入片段和載體連接的摩爾比例為3:1,如連接反應中加入載體40ng,插入片段大小為500bp,這時應加入插入片段的量為[40ng載體×0.5kb插入片段÷2.974kb載體]×3/1=20.2ng。
零背景平末端快速克隆試劑盒 T4原理